Το Διδυμότειχο κατά τη διάρκεια της Βυζαντινής Αυτοκρατορίας αποτελούσε μια από τις σημαντικότερες πόλεις και πολλές φορές είχε καταστεί διοικητική και στρατιωτική βάση της Αυτοκρατορίας.
Ο λόφος του Καλέ παρείχε έλεγχο ολόκληρης της περιοχής καθώς και μεγαλύτερη ασφάλεια σε σχέση με τον λόφο της Αγίας Πέτρας. Για το λόγο αυτό, τον 6ο μ.Χ. αιώνα, ο αυτοκράτορας Ιουστινιανός την οχύρωσε.
Μετά τον 7ο αιώνα εγκαταλείπεται η Πλωτινούπολη και αναπτύσσεται η Βυζαντινή οχύρωση στο λόφο του Κάστρου. Σημαντικό σταθμό αποτελεί η γέννηση του μετέπειτα αυτοκράτορα Ιωάννης Γ´ Δούκα Βατάτζη το 1193 στο Διδυμότειχο. Κατά τη Βυζαντινή περίοδο η πόλη γίνεται πρωτεύουσα της Βυζαντινής Αυτοκρατορίας τρεις φορές, ενώ το 1341, ο Ιωάννης ΣΤ΄ Καντακουζηνός επέλεξε το Διδυμότειχο για να στεφτεί αυτοκράτορας και να διαδεχτεί τον Ανδρόνικο Παλαιολόγο. Η στέψη του αυτοκράτορα έγινε με κάθε επισημότητα στις 26 Οκτωβρίου του 1341 στο ναό του Αγίου Γεωργίου του Παλαιοκαστρίτη (σήμερα Αρμένικη Εκκλησία).